YÜKSEK BASINÇLI SIVI KROMATOGRAFİSİ ( HPLC )


Kromatografi;  çeşitli maddelerin hareketli faz yardımıyla, sabit bir faz arasından değişik hızlarla hareket etmeleri esasına dayanır. HPLC; bir karışımdaki bileşenlerin ayrılmasında sıvı hareketli fazı kullanır. Bu bileşenler ilk olarak çözgende çözünürleştirilirler ve daha sonra yüksek basınç altında kromatografi kolonundan geçmeye zorlanırlar. Kromatografik ayırmada maddeler birbiriyle karışmayan iki faz arasında dağılırlar. Fazlardan birine hareketli (mobil) faz, diğerine ise durgun faz (stasyoner faz) denir.
Karışımdaki her maddenin hareket hızı, maddenin hareketli veya mobil faza olan ilgisine göre belirlenir. Hareketli faza daha çok ilgisi olan maddeler daha hızlı hareket ederler. Kolondan çıkan her maddenin konsantrasyon profili, pik olarak adlandırılır. Piklerin oluşturduğu tabloya da kromatogram adı verilir.
HPLC sistemi genel olarak 5 kısımdan oluşur
• Pompa: Pompanın görevi sıvının sistemde dolaşımını sağlamaktır. Dakikada akan mL cinsinden gösterilir.
• Enjektör: Genellikle enjekte edilen numune hacimleri 0.1- 20-mikrolitre (µL) arasındadır. Sistemdeki yüksek basınca dayanıklı olmalıdır. Oto örnekleyiciler analizcilerin zaman kaybını en aza indirecek şekilde   tasarlanmaktadır.
• Kolon: 5 – 100 °C arasında ayarlanabilmektedir, Kromatografik sistemin kalbi olarak nitelendirilir. Ayırma kolonda gerçekleşir. Durgun faz mm boyutlu poröz partiküllerden oluşur, bu nedenle hareketli fazın kolondan geçişi için yüksek basınç pompalarına ihtiyaç vardır. Ayrım, bileşenlerin fiziksel veya kimyasal özelliklerine göre gerçekleşir. Analizler için doğru kolon seçimini yapmak çok önemlidir.
• Dedektör: Kolonu terk eden bileşenleri görebilmemizi ve ayrılan moleküllerin miktarını belirlememizi sağlar. Dedektörden geçen maddeler bir kaydedici yardımıyla kaydedilerek, zamana karşı dedektör cevabına ait bir grafik oluştururlar buna da kromatogram denir  En çok kullanılan dedektörler; Spektroskopik, Floresans ve Kırılma indisidir.
 • Kaydedici
Bu kısımlardan bazıları çalışılacak bileşene göre değişiklik gösterebilir
Çalışma Prensibi
Kromatografik proses;
1.adım: Numunenin  uygun çözücüde çözünmesi
2.adım: Ayrım, Bileşenlerin ayrımı kolonda gerçekleşir, Kolon, çelik bir borudan oluşan içi silika jel ile doldurulmuş bir yapıdan oluşur. Çözünen karışım kolona enjekte edilir. Kolon boyunca sıvının hareket etmesi için bir basınç uygulanır, bu sıvı karışımına hareketli faz denir.
3.adım: Bileşenlerin miktarlarının tayin edilmesi, konsantrasyonu bilinmeyen bir örneğin solüsyonda tayin edilmesi; genelde örneğin standart çözeltisinin bilinen farklı miktarlarının kolona verilmesi ve elde edilen değerlerin korelasyonunun yapılması ile mümkün olabilmektedir. Genelde korelasyon pik alanları veya pik yüksekliklerinin kullanılması ile yapılır.
HPLC ile Yapılabilen Analizler
HPLC’de analize uygun kolon ve dedektör mevcut olduğu takdirde aşağıdaki tipik uygulamaları temsil eden çeşitli analizler yapılmaktadır.
Biyokimyasallar; amino asitler, proteinler, lipidler, karbohidratlar(früktoz,glukoz,sukroz,turanoz,maltoz)
Gıda maddeleri; Suni tatlandırıcılar, antioksidanlar, aflatoksin gibi bazı mikotoksinler, naftalin, hidroksimetilfurfural,
İlaçlar; antibiyotikler,steroidler, sedafitler.